Virus herpes canino en Chile: Propiedades biológicas (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Aislado viral. Se utilizó el
aislado viral denominado RP5, que produjo efecto
citopático en los cultivos inoculados y que
presentó alta reactividad en la detección de
antígenos de superficie del VHC-1 mediante
una prueba de inmunofluorescencia directa (Navarro y col
2003).

Cultivos celulares. Se prepararon cultivos
celulares de la línea MDCK (Madin-Darby Canine Kidney,
catálogo ATCC: CCL-34), originaria de riñón
canino. Se cultivaron a 37 °C en medio esencial mínimo
de Eagle (MEM), adicionado con antibióticos (penicilina
(100U/ml), estreptomicina (100 µg/ml)) y suplementado con
10% de suero fetal bovino.

Caracterización biológica parcial del
aislado RP5. La caracterización biológica del
aislado RP5 contempló la cuantificación de su
infectividad y la determinación de su sensibilidad frente
a un solvente lipídico. Posteriormente se verificó
la formación de cuerpos de inclusión intranucleares
y se determinó su velocidad de
multiplicación.

Cuantificación de la infectividad. Para
medir la infectividad del aislado RP5 se utilizó el
procedimiento
de titulación por dilución punto final (DPF) que
permiten conocer la cantidad de agente infeccioso contenido en 1
ml, con capacidad de infectar el 50% de los cultivos celulares
susceptibles. Para realizar la cuantificación se
utilizó la línea celular MDCK, que se
propagó en tubos serológicos en
concentración de 8×104 células
por mL. Transcurridas 24 horas, se procedió a inocular
estas células con diluciones en base 10 (desde
10-1 hasta 10-8) en volúmenes de 200
uL, empleando 6 tubos por dilución del agente infeccioso.
Se incubó durante una hora a 32-33 °C. Luego se
retiró el sobrenadante y se reconstituyó el
volumen
original (1,5 mL) con medio de cultivo celular de
mantención. Posteriormente se incubó a la misma
temperatura
con observación diaria durante 5 días y
se registró el tiempo de
aparición de ECP. El título fue calculado por el
Método de
Reed y Müench (1938), que permite determinar la
dilución del agente infeccioso que produce ECP en el 50%
de los cultivos celulares inoculados.

Determinación de la sensibilidad frente a
solvente lipídico. Para confirmar la presencia de
envoltura en el aislado RP5, se determinó su sensibilidad
frente a cloroformo, mediante el protocolo de
Feldman y Wang (1961). Este método consiste en formar una
mezcla de 1 parte de cloroformo y 19 partes del inóculo
viral (100 DCIT50), la cual se mezcló mediante
agitación durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se centrifugó a 500xg durante 5 minutos y
la fracción libre de cloroformo fue utilizada como
inóculo. Como control de
infección se utilizó un inóculo sin mezclar
con cloroformo y para verificar integridad celular se
utilizó una mezcla de cloroformo y medio de cultivo
(1:19). Ambos controles siguieron el mismo procedimiento descrito
para la mezcla cloroformo: inóculo. Posterior al
tratamiento se midió la infectividad del aislado sometido
a la acción
del cloroformo mediante el procedimiento de titulación DPF
descrito anteriormente.

Formación de cuerpos de inclusión.
El procedimiento consistió en la observación de
células de la línea celular MDCK dispuestas en
laminillas de vidrio dentro de
tubos de Leighton. Las células, sembradas en
concentración de 8×104 /mL, fueron incubadas
durante 24 horas en una estufa de cultivo a 37 °C. Luego de
verificar presencia de monocapa celular en la laminilla de
vidrio, se procedió a retirar el medio de cultivo para
agregar 300 uL de inóculo viral (100 DCIT50)
sobre la laminilla de vidrio e incubar a 32-33 °C durante una
hora en estufa de cultivo. Transcurrido este tiempo, se
procedió a completar el volumen con medio de cultivo
adicionado con 5% de suero fetal bovino, como medio de mantenimiento.
Transcurridas 16 horas postinoculación, se procedió
a colectar las laminillas infectadas y de control. Las
células fueron fijadas mediante la adición de
acetona fría (-20 °C) durante 10 minutos y posterior
lavado en PBS. Se dejaron secar a temperatura ambiente y se
procedió a realizar la tinción Hematoxilina-eosina,
que consistió en un lavado bajo agua
corriente, luego se sumergió en hematoxilina (2g/L) por 5
minutos. Enseguida, se sumergió 3 veces en una
solución diferenciadora (alcohol 70% +
HCl) y posteriormente en agua durante un minuto. Transcurrido el
tiempo, se sumergió en eosina 1-2 % durante 10 a 15
segundos, se lavó rápidamente con agua destilada y
se sumergió sucesivamente durante un minuto en soluciones
alcohólicas de 70, 95 y 100%. Finalmente, se lavó
rápidamente con xilol, y posteriormente la laminilla fue
montada invertida sobre un portaobjetos, previa adición de
una gota de bálsamo de Canadá. La
visualización se realizó mediante un microscopio de
luz
convencional, utilizando aumentos de 200X y 1000X.

Determinación de la velocidad de
multiplicación. Para la realización de esta
experiencia se prepararon monocapas de células MDCK
dispuestas en tubos serológicos. A las 24 horas, se
procedió a inocular 40 tubos con 200uL de una dosis de 100
DICT50 del agente infeccioso, y como control, sin
infectar se mantuvieron 20 tubos serológicos con su
respectiva monocapa celular intacta. La experiencia
contempló los siguientes tiempos de reacción: 0;
0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22; 24; 36; 48; 72
horas y en cada tiempo se dispuso de duplicados. Para cada
tiempo, cada muestra fue
separada en sobrenadante (ST) y monocapa celular
(PT) y se congeló a _20 °C, hasta terminar
el proceso
completo (72 horas). Luego se procedió a efectuar tres
ciclos de congelamiento/descongelamiento de las muestras
PT, con el objetivo de
romper las células presentes y facilitar la
liberación del eventual virus. En el caso
de los sobrenadantes, éstos se utilizaron sin
modificación. Cada una de estas muestras fue considerada
como inóculo particular y se realizaron diluciones en
medio de cultivo, con el fin de medir el título viral para
cada uno de los tiempos, tanto para el virus intracelular
(muestras PT) como para el virus extracelular
(muestras ST), en forma análoga como se
describió anteriormente.

RESULTADOS

Cuantificación de la infecciosidad del agente
infeccioso. Al inocular diluciones del aislado
RP5 sobre monocapas de células MDCK en el procedimiento de
titulación viral (Método de Reed y Müench
1938) se encontró un valor de
DICT50 = 105,5 / 0,2 mL, es decir,
DICT50 = 1,58 x 106/mL.

Sensibilidad del aislado RP5 a solvente
lipídico. En ninguna de las experiencias realizadas
con el inóculo tratado con solvente lipídico se
reprodujo el ECP característico: lisis celular. Las
monocapas inoculadas no sufrieron desprendimiento sino hasta 10
días postinoculación, al igual que el control sin
infectar y las monocapas inoculadas con la mezcla
cloroformo/medio de cultivo. Esto sugiere que el desprendimiento
celular final se produjo por el evidente sobrecrecimiento celular
observado, descartando un eventual efecto tóxico. Los
resultados descritos contrastan con lo observado al inocular con
diluciones del control positivo (inóculo sin tratamiento
con cloroformo), que produce ECP visible a las 24
horas.

Formación de cuerpos de inclusión.
La figura 1 muestra la existencia de cuerpos de inclusión
intranucleares (teñido en rosado oscuro) en
comparación con el citoplasma (teñido en rosado) en
cultivos de células de la línea MDCK inoculados con
el aislado RP5.

La figura 2 centra la atención en una célula en
especial que muestra la apariencia de una célula
teñida en azul (citoplasma) y un núcleo agrandado
(azul oscuro) con presencia de cuerpos de inclusión
típicos de herpesvirus. En la figura 1 es posible,
además, observar un foco de destrucción celular,
similar al observado en los cultivos celulares, foco formado por
el desprendimiento celular posterior a la formación del
racimo ("cluster") de células.

Determinación de la velocidad de
multiplicación. La figura 3 muestra la
curva de crecimiento del aislado RP5. Esta curva representa la
aparición de viriones en el interior de la célula
(azul), como también la aparición de viriones en el
sobrenadante o extracelular (rojo). Cada punto en el tiempo
representa, en cada caso, el logaritmo negativo del valor de
DICT50/ml. Esta curva mostró un aumento
progresivo del título viral en el interior de la
célula entre las 4 y las 6 horas postinfección
(pi.), alcanzando un máximo entre las 14 y 16 horas pi. A
partir de esa hora se apreció una disminución
progresiva en el tiempo. Respecto de la aparición de
viriones en el exterior de la célula, fue posible observar
un aumento significativo entre las 6 y 8 horas pi., alcanzando un
máximo a las 16 horas pi. Luego, se aprecia una leve
disminución del título viral. Si bien ambas curvas
mostraron un comportamiento
inicial similar y sólo desfasado en el tiempo, luego de
alcanzar un valor máximo, los títulos del agente
infeccioso declinaron a valores
menores pero no iguales, pues al término de la experiencia
(72 horas) se observó que el título viral es mayor
en el exterior de las células infectadas, diferencia que
es mayor a dos órdenes de magnitud, es decir, se logra un
DICT50 = 104 /mL para el virus intracelular
en comparación con el DICT50 =
3×106/mL para el virus extracelular.

DISCUSIÓN

El virus herpes canino
produce la enfermedad hemorrágica en cachorros menores de
cuatro semanas. Esta aseveración fue validada hace
bastante tiempo atrás, en Estados Unidos de
Norteamérica, al describirse este virus (Carmichael y col
1965). Desde entonces, es posible encontrar algunos informes que
muestran diferentes enfoques a este problema y que le asignan
presentación mundial. Esto último se refleja en los
resultados obtenidos en esta investigación al someter al aislado RP5 a
la caracterización biológica, que en conjunto con
la identificación antigénica informada con
anterioridad (Navarro y col 2003) concuerdan con los descritos en
la literatura
para el VHC-1, perteneciente a la familia
Herpesviridae, subfamilia
Alphaherpesvirinae.

En este estudio, luego de conocer el título del
aislado RP5, se demostró la presencia de envoltura viral
mediante el tratamiento del inóculo con cloroformo. La
observación de ECP sólo en los controles positivos
de infección, resultó decisiva. La
explicación para este resultado, residiría en que
estos viriones poseen una envoltura externa compuesta de proteínas,
lípidos y
carbohidratos.
Esto indica que, al preincubar el aislado RP5 en presencia del
solvente orgánico, se destruyó la envoltura, con lo
cual la condición infectante se perdió. Si en los
cultivos inoculados se hubiera observado ECP, este efecto
podría explicarse por la presencia de un virus alternativo
sin envoltura o por un efecto tóxico residual del
cloroformo sobre la monocapa celular.

Por otra parte, la presencia de cuerpos de
inclusión intranucleares eosinófilos resultó
compatible con el mecanismo de replicación descrito para
los virus herpes (Murphy y col 1999).

La siguiente evidencia que apoya la presencia de un
virus herpes fue la obtención de una curva de
aparición de viriones, tanto en el sobrenadante como en el
interior de las células infectadas, que concuerdan
temporalmente con las descritas para los virus herpes de la
subfamilia Alphaherpesvirinae (Kaplan y Vatter 1959). El
análisis de ambas curvas sugiere una
acumulación inicial de viriones en el interior celular y
posteriormente en el sobrenadante; es decir, el virus ingresa a
la célula, se multiplica y realiza un ciclo lítico.
Si bien este ECP puede ser observado a partir de las 16 horas, la
curva de crecimiento viral indicaría que este efecto se
inicia mucho antes, entre las 6 y 8 horas
postinoculación.

Las evidencias
encontradas en esta investigación permiten concluir que el
aislado RP5 no sólo se comporta antigénicamente
como el VHC-1 (Navarro y col 2003) sino que, además,
comparte algunas de sus propiedades biológicas.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Raquel Cepeda Canales, del Departamento de
Ciencias
Biológicas y al Dr. Carlos González Riveros, del
Departamento de Patología Animal, ambos de la Facultad de
Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de
Chile, por su importante asesoría, fundamental en la
obtención de los resultados referentes a cuerpos de
inclusión intranucleares.

REFERENCIAS

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# Proyecto FIV
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Universidad de Chile.
2 Instituto de Ciencias Biomédicas. Facultad de
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Universidad de Chile.